Ratusan tahun yang lalu, di jaman feodal Jepang, terdapat sebuah klan ninja yang sangat ditakuti, yang bernama The Foot Clan. Mereka dipimpin oleh dua orang samurai tangguh yang bernama Oroku Saki dan Hamato Yoshi. Saki berniat membuat reputasi The Foot Clan lebih ditakuti dengan berencana melakukan penghancuran dan pembunuhan lebih banyak lagi.
Tetapi hal itu ditentang oleh Yoshi, dan kemudian memutuskan keluar dari The Foot Clan. Sayang, tindakan Yoshi tersebut berakibat fatal. Saki yang menganggap Yoshi berkhianat memutuskan membunuh Yoshi termasuk istrinya, Tang Shen bersama keempat anaknya. Dalam sebuah serangan, Tang Shen tewas. Sebelum meninggal, Tang Shen berpesan pada Yoshi agar tidak membalas dendam demi keselamatan anak-anak mereka. Yoshi memutuskan bersembunyi di sebuah gunung terpencil bersama keempat anaknya.
Sayang persembunyian mereka diketahui Saki. Dengan kekuatan besar Saki menyerang persembunyian Yoshi. Yoshi dan anak-anaknya berhasil ditangkap. Sebelum mengeksekusi Yoshi, Saki terlebih dahulu memenggal keempat anak Yoshi di depan ayahnya. Sebelum dieksekusi, Yoshi berdoa semoga dia di kehidupan mendatang dapat bertemu dengan anak-anaknya dan bersumpah bahwa dia akan bertemu dan membuat perhitungan dengan Saki.
Kota New York masa kini, di sebuah laboraturium milik Stockgen, sebuah perusahaan bio-tech pimpinan Baxter Stockman, terdapat seekor tikus dan empat ekor kura-kura yang menjadi semacam binatang percobaan. Tikus tersebut sangat pintar sehingga disukai oleh para ilmuwan disitu. dan mereka menamainya Splinter, karena sifat tikus itu yang aneh karena tidak mau bergabung dengan kelompok tikus lain, tetapi lebih memilih bersama keempat kura-kura kecil. Sedangkan keempat kura-kura kecil tersebut dinamai Leonardo, Micheangelo, Donatello dan Raphael. Yang menamainya adalah April O'Neil, ilmuwan cewek yang memang tertarik dengan sejarah Reinassance.
Suatu malam, dua orang perampok menyerang laboratorium tersebut dan mengambil semua spesimen dan cairan genetik lainnya. April yang sedang bertugas jaga nyaris terbunuh dan berhasil lolos jika saja Splinter tidak membunyikan alarm kebakaran. Tetapi keempat kura-kura berhasil dibawa kabur oleh sang pencuri. Splinter tidak tinggal diam, dia berusaha menyelamatkan keempat teman-temannya. Usahanya berhasil. Di sebuah gang yang gelap, dia berhasil menggigit muka dan tangan sang pencuri sehingga keempat kura-kura tersebut berhasil terlepas. Sayang, sebuah tabung kaca pecah dan isinya berupa cairan hujau mengenai tubuh mereka.
Masalah belum selesai, seekor kucing liar menggondol seekor kura-kura dan bermaksud menyantapnya. Splinter langsung menyerang kucing tersebut dan berhasil mengusir sang kucing setelah membutakan sebelah matanya. Dengan susah payah, Splinter berhasil membawa keempat kura-kura ke sebuah selokan. Ternyata cairan hijau yang mengenai tubuh mereka bukan cairan sembarangan. Reaksinya sungguh luar biasa. Mereka dalam waktu singkat tumbuh besar sebesar manusia. Bahkan sanggup berjalan tegak dan berbicara satu sama lain.
Dan terungkap bahwa Splinter adalah reinkarnasi dari Hamato Yoshi dan para kura-kura tersebut adalah reinkarnasi dari anak-anaknya. Doa Yoshi terkabul dan dia sangat bahagia dapat bertemu dengan anak-anaknya kembali. Tapi ternyata ada satu kura-kura yang hilang, yang bernama Raphael. Raphael kabur dan terpisah saat mereka diserang kucing tersebut. Hamato Yoshi, yang kini memutuskan memakai nama Splinter, ingatannya tentang masa lalunya telah pulih begitu juga kemampuan beladirinya. Dan dia mengajarkan kepada ketiga anak-anaknya ilmu beladiri ninja. Dan tujuan mereka sekarang adalah mencari Raphael.
Pencarian terhadap Raphael terus dilakukan. Mereka bahkan harus menghadapi musuh pertama mereka yaitu sebuah geng yang dipimpin oleh seekor mutant kucing bernama Old Hob. Old Hob sangat dendam pada Splinter yang telah membutakan satu matanya. Yup!! Old Hob adalah kucing yang bermaksud memangsa kura-kura tersebut. Kucing tersebut juga terkena cairan dan mengalami mutasi dan menjadi mutant seperti Splinter.
Tapi geng Old Hob selalu dapat dikalahkan oleh Splinter dan para kura-kura. Lantas dimanakah sebenarnya Raphael? Ternyata Raphael berjalan tak tentu arah. Dalam perjalanannya dia menyelamatkan seorang remaja bernama Casey Jones yang sedang dihajar ayahnya.
Mereka berdua pun menjadi sahabat. Walau terlihat lemah, ternyata Casey pandai bertarung dan suka menghajar penjahat.
Sayang mereka berdua bertemu dengan Old Hob and the gang. Untunglah disaat kritis tersebut, kura-kura lain muncul dan langsung memberi pertolongan. Dengan kembalinya Raphael, maka lengkap sudah keempat kura-kura tersebut. Splinter kemudian memutuskan memberi hadiah bagi murid-muridnya tersebut yaitu empat buah pita dengan empat warna berbeda. Dimana masing-masing akan mendapatkan warna yang sesuai dengan kepribadiannya. Mereka berlima bertekad akan melindungi kota New York dari segala bentuk kejahatan yang mengancam.
Suatu malam, saat berpatroli, keempat kura-kura memergoki dua orang ninja sedang bertarung dengan seseorang yang berilmu savate. Melihat pertarungan yang tidak imbang, mereka bermaksud menolong, sayang terlambat. Kedua ninja itu kabur meninggalkan korbannya yang sekarat. Sebelum mati, orang tersebut mengatakan "perang akan terjadi".
Entah apa maksudnya, tapi menurut Splinter, kemungkinan besar The Foot Clan ada di New York dan terlibat konflik dengan sebuah klan savate. Splinter berpesan pada murid-muridnya agar tidak terlibat lebih jauh dan bersikap netral. Amankah mereka, ternyata tidak karena tiba-tiba markas mereka diserang oleh ribuan robot kecil nan ganas. Serangan mendadak ini membuat mereka kocar-kacir karena di markas hanya ada Leaonardo dan Donatello mendampingi Splinter. Mereka bertiga nyaris tewas karena kekuatan yang tidak seimbang tersebut.
Untunglah disaat genting, Mikey dan Raph yang sedang pergi membeli pizza, datang tepat waktu. Robot-robot tersebut berhasil dikalahkan. Tetapi Splinter menghilang. Ternyata serangan tersebut dilakukan oleh Old Hob dan hanya pancingan karena Splinter adalah sasaran utamanya. Old Hob menculik Splinter atas suruhan Baxter karena dia butuh darah Splinter untuk memproduksi dan mengembangkan mutagen, cairan hijau yang menjadikan Splinter dan para kura-kura mutant. Mutagen tersebut merupakan pesanan dari seseorang yang bernama General Krang.Kita beralih dulu ke Casey. Casey yang butuh pekerjaan bermaksud melamar pada seseorang yang mencari pelatih beladiri. Ternyata orang tersebut adalah April, yang trauma karena serangan di lab-nya yang nyaris membunuhnya, dan dia bermaksud berlatih beladiri agar dapat melindungi diri. Casey yang mengetahui bahwa April bekerja di Stockgen bermaksud mengajaknya menemui para kura-kura karena siapa tahu April dapat menolong mereka. Tetapi rupanya kedatangan mereka disaat yang tidak tepat karena markas kura-kura yang telah hancur dan Splinter yang menghilang.
April yang akhirnya tahu bahwa mereka adalah kura-kura yang ada dilab-nya, bermaksud membantu menolong Splinter yang dibawa Old Hob ke laboratorium Stockgen. Mereka langsung menuju lab tersebut. Sayangnya mereka terlambat, karena ternyata lab tersebut telah diserang dan Splinter dibawa berhasil dibawa kabur. Dari keterangan seorang ilmuwan disitu, pelakunya adalah para ninja. Apakah The Foot Clan? Yup, dipimpin seorang kunoichi bernama Karai, merekalah yang menculik Splinter dan membawanya menemui sang pimpinan yang disebut Shredder.
Ternyata The Foot Clan mengajak Splinter bergabung bersama mereka, karena mereka tertarik dengan kemampuan beladiri Splinter. Jelas Splinter menolak mentah-mentah. Dia pun bercerita bahwa dia dulunya adalah anggota The Foot Clan dan karenanya dia harus kehilangan keluarganya. Shredder yang mendengar cerita Splinter sangat terkejut karena ternyata Shredder adalah Oroku Saki!! Splinter pun tidak kalah terkejutnya karena musuh bebuyutannya masih hidup. Tetapi rupanya Saki tidak mau berurusan lagi dengan Yoshi dan langsung memerintahkan Karai untuk membunuhnya.
Tetapi Splinter dapat mengalahkan semua anak buah Karai. Shredder pun maju untuk membunuh Splinter. Pertarungan sengit terjadi. Splinter yang sudah tua dan hanya mempunyai badan tikus yang lemah tidak mampu mengimbangi kekuatan Shredder sehingga kalah telak. Beruntung di saat kritis para kura-kura dibantu Casey Jones datang menyerbu. Pertempuran besar terjadi. Shredder, Karai dan anak buahnya berhasil dikalahkan. Tetapi karena keselamatan Splinter adalah prioritas, para kura-kura tak ingin memperpanjang pertarungan dan memilih meninggalkan Shredder.
Shredder menganggap masalah belum selesai bersumpah akan menghancurkan Splinter dan para kura-kura. Splinter dan para kura-kura menyadari bahwa mereka telah menemukan musuh bebuyutan yang sebenarnya, yang sangat kuat dan berbahaya, yang siap mengancam mereka kapan saja. Dan mulai detik inilah, perang sesungguhnya telah dimulai...

Guru dari para kura-kura dan reinkarnasi dari mantan pimpinan The Foot Clan, Hamato Yoshi. Awalnya dia tidak mau berurusan dengan The Foot Clan. Setelah mengetahui Oroku Saki adalah Shredder, dia bertekad melawan The Foot Clan, yang telah memberikan banyak penderitaan bagi keluarganya. Sebenarya ilmu ninjutsunya sangat tinggi, namun faktor usia dan tubuh tikusnya yang lemah membuatnya sering kalah dalam pertempuran.

Leo adalah pemimpin dari para kura-kura. Dia juga merupakan reinkarnasi dari anak tertua Yoshi. Sifatnya tegas dan berwibawa. Keberaniannya dan kemampuan memimpinnya membuatnya disegani kawan maupun lawan. Bahkan Shredder sangat tertarik pada Leo dan berniat menjadikannya second-in-command. Senjatanya adalah dua bilah pedang katana, yang bernama Musashi dan Kamizumi.

Diantara para kura-kura, Mikey adalah yang paling badass dan suka bercanda. Dia juga yang paling maniak pizza diantara saudara-saudaranya. Sering bertindak diluar perhitungan, sehingga kadang merepotkan saudara-saudaranya. Walau begitu kemampuannya dalam memainkan nunchuck tidak bisa dianggap remeh.

Donnie adalah kura-kura yang paling pintar dan cerdas bak profesor diantara lainnya. Dia juga mampu menciptakan alat-alat canggih dengan kecerdasannya. Ketertarikannya akan sains bahkan sudah terlihat saat dia masih berwujud kura-kura kecil, yang selalu menatap serangga di aquarium.

Raph adalah kura-kura paling kuat, tetapi kadang bertindak diluar perhitungan. Sifatnya yang emosional. keras dan susah diatur membuatnya sering berselisih dengan Leo. Sering bertindak sendirian mengikuti emosinya. Bahkan dia nyaris menghajar Old Hob hingga tewas jika tidak dicegah kura-kura lainnya.

Seorang pemuda broken home sekaligus sahabat karib Raph. Sering berselisih dengan ayahnya, Hun, ketua dari geng Purple Dragons. Dia selalu keluar malam-malam bertopeng hockey untuk menghajar penjahat. Karena ketrampilannya berkelahi dia diminta April untuk melatihnya. Karena sering berduaan, mereka jadi tertarik satu sama lain (pacaran maksudnya).

Seorang ilmuwan dari Stockgen yang ikut bagian dalam pengembangan mutagen. April lah yang memberi nama Splinter dan para kura-kura dengan nama-nama seniman jaman Reinassance. Dia memutuskan keluar dari Stockgen dan membantu para kura-kura setelah mengetahui kejahatan perusahaan tempatnya bekerja. April bener-bener jatuh cinta pada Casey. Terbukti saat Casey terluka, dia rela menunggunya di rumah sakit.

Angel adalah sahabat Casey sekaligus pimpinan geng The Purple Dragons sebelum posisinya digeser Hun. Dia memutuskan keluar setelah tahu geng-nya bergabung dengan The Foot Clan. Angel akhirnya membantu Casey dan para kura-kura melawan The Foot Clan. Bahkan saat Splinter diculik, dia membantu para kura-kura bertempur dengan pasukan Karai.

Harold adalah ilmuwan rada sinting sahabat Donnie. Awalnya dia tidak mau berurusan dengan para kura-kura setelah tahu akan berurusan dengan The Foot Clan, tetapi setelah dibujuk terus oleh Donnie, dia akhirnya mau juga. Seperti halnya Donnie, dia juga banyak menciptakan alat-alat canggih seperti anty-gravity glove (yang dipakai Donnie), exo-suit (yang dipakai oleh Angel) dan sebuah robot kura-kura yang bernama Metal Head yang sangat kuat.

Alopex adalah mutant rubah betina yang awalnya adalah anggota The Foot Clan. Tetapi melihat kekejaman Shredder dia berbalik melawan The Foot Clan. Alopex berniat bergabung bersama kelompok kura-kura, tetapi ditentang oleh Raphael, yang curiga kenapa setelah kehadiran Alopex justru serangan makin banyak terjadi. Walaupun awalnya membenci Alopex tapi lama-lama Raph bisa menerima kehadirannya dan mereka berdua menjadi sahabat (kayaknya sih menjurus pacaran).

John & Beth adalah orang tua dari April. John merupakan mantan ilmuwan Stockgen yang pensiun karena lumpuh terkena stroke sedangkan Beth adalah mantan reporter TV Channel Six. Mereka berdua yang memberi tempat perlindungan pada para kura-kura dan kelompoknya saat melarikan diri ke Nothhampton. John akhirnya sembuh dari stroke setelah diberi cairan mutagen oleh April. Mereka berdua akhirnya pindah ke kota tinggal bersama April dan Casey.