Walaupun dibentuk tahun 1964, grup musik Barrett yang nantinya bernama Pink Floyd berkali-kali mengalami pergantian personel dan nama, seperti "The Abdabs", "The Screaming Abdabs", "Sigma 6", dan "The Meggadeaths". Pada tahun 1965, Barrett mendirikan grup "The Tea Set", tapi ketika mengetahui sudah ada grup musik dengan nama yang sama, ia mengubah nama band menjadi, "The Pink Floyd Sound" (nantinya disebut "The Pink Floyd"). Nama "Pink Floyd" diciptakan Barrett dari gabungan nama depan penyanyi blues Amerika Serikat, Pink Anderson dan Floyd Council. Barrett melihat kedua nama tersebut pada sampul piringan hitam gitaris blues Blind Boy Fuller (1962) yang ditulis Paul Oliver.
Karier bermusik Pink Floyd diawali dengan membawakan lagu-lagu yang pernah dibawakan pemusik R&B asal Amerika Serikat. Baru pada tahun 1966, mereka memulai gaya sendiri dalam rock and roll dengan mengambil unsur jazz dan pop-rock Inggris. Pada waktu itu di London dibuka arena konser baru, UFO Club dan segera menjadi pusat musik psychedelic Inggris. Pink Floyd yang berpentas secara tetap di sana, menjadi atraksi paling populer di klub UFO. Setelah tampil di area seni Roundhouse yang menjadi pesaing klub UFO, Pink Floyd semakin dikenal dalam budaya musik psychedelic di London yang disebut "London Underground".
Di akhir tahun 1966, Pink Floyd mendapat dua orang manajer yang bisa diandalkan, Andrew King dan Peter Jenner. Keduanya berteman dengan ekspatriat asal AS, Joe Boyd yang nantinya menjadi tokoh penting dalam industri rekaman Inggris. Boyd bertindak sebagai produser Pink Floyd, dan mengajaknya rekaman di studio Sound Techniques, Chelsea, Januari 1967. Hasilnya adalah demo single Arnold Layne. King dan Jenner membawa lagu tersebut ke perusahaan rekaman EMI yang begitu terkesan, dan mengontrak Pink Floyd untuk rekaman album. Setelah album mereka dirilis, singel Arnold Layne masuk ke urutan ke-20 tangga singel Britania (walaupun ditolak untuk diputar di BBC). Kesuksesan ini diikuti singel See Emily Play yang lebih laku, dan menduduki urutan ke-6 tangga singel Britania.
Barrett menulis kedua singel perdana Pink Floyd dan singel ketiga, Apples and Oranges. Sebagian besar lagu-lagu di masa awal Pink Floyd, dan konsep album The Piper at the Gates of Dawn (1967) juga ditulis oleh Barrett. Judul album The Piper at the Gates of Dawn diambil dari bab berjudul sama yang ada dalam buku cerita anak The Wind in the Willows. Barrett menulis 8 dari 11 lagu album Piper, dan turut menulis 2 lagu lainnya. Barrett dikenal sebagai gitaris yang penuh inovasi dan senang bereksperimen. Salah satu ciri khasnya adalah memainkan gitar Fender Esquire dengan pemantik api Zippo. Barrett memainkannya turun naik pada fret gitar lewat perangkat echo box model lama. Suara gitar yang keluar begitu misterius bagaikan dari alam lain yang menjadi ciri khas Pink Floyd.
Album The Piper at the Gates of Dawn direkam dalam berbagai sesi rekaman dari Januari hingga Juli 1967 di Studio 2, Abbey Road Studios. Di tempat yang sama dan waktu yang bersamaan, Beatles sedang rekaman album Sgt. Pepper's Lonely Hearts Club Band di Studio 1, sedangkan grup Pretty Things sedang merekam S.F. Sorrow. Setelah dirilis di bulan Agustus tahun yang sama, album Piper menempati urutan ke-6 tangga album Britania Raya. Penggemar Pink Floyd menjadi semakin bertambah, dan Barrett semakin tertekan hingga kesehatan jiwanya semakin terganggu.
Tingkah laku Barrett semakin hari semakin bertambah sulit diperkirakan. Salah satu penyebabnya adalah kegemaran Barrett bereksperimen dengan obat-obatan psychedelic seperti LSD. Di atas panggung, Barrett dilaporkan sering hanya mengulang-ulang satu kord, atau bahkan tidak bermain sama sekali. Pada pertunjukan di The Fillmore West, San Francisco, permainan Barrett semakin kacau. Walaupun penonton kelihatan menikmatinya, rekan-rekannya semakin cemas melihat perkembangan Barrett. Sebelum konser Pink Floyd pada akhir tahun 1967 dimulai, Barrett menumbuk butiran obat Mandrax yang dicampurkannya dengan satu tube krim rambut Brylcreem, lalu dioleskan ke rambut. Di atas panggung, krim rambut tersebut meleleh ke bagian muka akibat panasnya sorotan lampu. Barrett terlihat seperti "lilin yang terbakar pelan-pelan." Bagian cerita tentang Mandrax dibantah Nick Mason dalam biografi Barrett yang diberi judul Madcap. Gambar Syd dengan krim rambut yang meleleh nantinya digunakan pada film The Wall.
Setelah pertunjukan di Amerika Serikat, Pink Floyd meminta David Gilmour (teman sekolah Barrett) untuk bergabung sebagai pemain gitar cadangan, kalau-kalau tingkah laku Barrett yang semakin kacau membuatnya tidak lagi bisa bermain gitar. Dalam sejumlah pertunjukan, Gilmour bermain gitar menggantikan Barrett, sementara yang digantikan hanya mondar-mandir di atas panggung, dan cuma sekali-sekali saja mau ikut bermain. Tingkah laku aneh Barrett semakin membuat rekan-rekannya kehilangan kesabaran. Dalam perjalanan untuk manggung di Universitas Southampton, bulan Januari 1968, Barrett tidak lagi dijemput oleh rekan-rekannya dan dipensiunkan dari Pink Floyd. Barrett ingin dipertahankan sebagai penulis lagu namun tidak berhasil.
Album A Saucerful of Secrets yang dirilis tahun 1968 merupakan album terakhir Pink Floyd yang berisi lagu ciptaan Barrett. Dari lagu-lagu ciptaan Barrett yang ditulis setelah album perdana, hanya lagu "Jugband Blues" yang dimasukkan ke album kedua, A Saucerful of Secrets. Singel "Apples and Oranges" yang ditulisnya ternyata tidak terlalu sukses. Dua lagu ciptaan Barrett yang lain, "Scream Thy Last Scream" dan "Vegetable Man" tidak pernah diedarkan secara resmi. Barrett dilaporkan datang ke studio menunggu giliran diajak bermain oleh rekan-rekannya. Ia juga hadir sebagai penonton dalam pertunjukan Pink Floyd sambil terus-menerus menatap Gilmour. Barrett memainkan slide guitar untuk "Remember a Day" dan "Set the Controls for the Heart of the Sun" (seperti dituturkan Gilmour dalam wawancara dengan majalah Guitar World tahun 1993). Pada bulan Maret 1968, Barrett secara resmi dinyatakan bukan lagi anggota Pink Floyd